【一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法】在分子生物学研究中，融合蛋白的表达与纯化是获取功能蛋白的重要手段。其中，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签常被用于提高目标蛋白的可溶性和便于后续纯化。TRAF6是一种重要的信号转导蛋白，在NF-κB通路中起关键作用。为了研究其结构与功能，研究人员常通过基因工程技术将TRAF6与GST标签融合，并在大肠杆菌中进行表达。本文介绍一种从大肠杆菌包涵体中分离和纯化GST-TRAF6融合蛋白的实验方法。

一、实验原理

当重组蛋白在大肠杆菌中过量表达时，常常会形成不溶性的包涵体。虽然包涵体中的蛋白通常具有正确的氨基酸序列，但需要经过变性与复性处理才能恢复活性。本实验利用GST标签的亲和特性，通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶对融合蛋白进行特异性吸附，从而实现高效纯化。

二、实验材料与设备

1. 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞

2. pGEX-4T-1-GST-TRAF6重组质粒

3. LB液体培养基

4. IPTG诱导剂

5. 谷胱甘肽琼脂糖凝胶（Glutathione Sepharose 4B）

6. PBS缓冲液、裂解液、洗涤液、洗脱液

7. 离心机、恒温摇床、层析柱、紫外分光光度计等

三、实验步骤

1. 菌株培养与诱导表达

将含有pGEX-4T-1-GST-TRAF6的BL21菌株接种于LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600约为0.6。加入IPTG至终浓度为0.5 mM，继续培养4小时以诱导融合蛋白的表达。

2. 菌体收集与裂解

离心收集菌体，用PBS重悬后超声破碎，释放包涵体。随后离心去除碎片，取上清液备用。

3. 包涵体洗涤与溶解

将沉淀物用裂解液悬浮并离心，重复洗涤数次。随后加入变性剂（如8 M尿素）溶解包涵体，得到变性后的融合蛋白溶液。

4. 亲和层析纯化

将溶解后的蛋白溶液加入预先平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱中，使GST标签与凝胶结合。依次用洗涤液和洗脱液进行洗脱，收集含有GST-TRAF6的洗脱组分。

5. SDS-PAGE分析

取不同阶段的样品进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白条带是否符合预期，评估纯化效果。

6. 透析与复性

对洗脱液进行透析，逐步降低盐浓度，使蛋白恢复天然构象。

四、注意事项

- 在诱导过程中需控制好IPTG浓度与培养时间，避免蛋白过度聚集或降解。

- 包涵体的洗涤应充分，以减少杂质残留。

- 变性条件需根据实验情况优化，避免蛋白失活。

- 层析过程中应保持低温操作，防止蛋白降解。

五、结论

通过上述方法，可以从大肠杆菌包涵体中成功分离和纯化出具有生物活性的GST-TRAF6融合蛋白。该方法操作简便、重复性强，适用于实验室规模的蛋白制备，为后续的功能研究提供了可靠的实验基础。